摘要：本研究利用制冷恒温槽，测定酿酒酵母在15℃、10℃和4℃条件下的生长曲线，评估低温对酵母生长速率和平台期浓度的影响。实验结果表明，该设备具有良好的温度均匀性和稳定性，能够为微生物低温培养实验提供可靠的恒温环境。
一、实验目的
酵母菌的最适生长温度一般为28-30℃，但在某些研究场景下（如冷休克蛋白表达、低温适应性研究、食品发酵工艺优化等），需要考察其在低温条件下的生长特性。
本实验旨在：
1、 测定酿酒酵母在15℃、10℃和4℃三个低温点的生长曲线
2、 比较不同低温条件下酵母的延滞期长度、对数期生长速率和平台期菌液浓度
3、 验证制冷恒温槽在微生物低温培养实验中的适用性
二、实验材料与仪器
菌种与试剂
1、 菌种：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），实验室保存菌株
2、 培养基：YPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）
3、 无水乙醇：分析纯，含量≥95.5%
主要仪器
1、 RTS-80N型制冷恒温槽（上海赫田科学仪器有限公司）
2、 无菌试管（15mm×150mm）
3、 紫外可见分光光度计
4、 超净工作台
5、 恒温摇床
制冷恒温槽主要技术参数：
1、 温控范围：-80～95℃
2、 温度波动度：±0.01℃/10min
3、 温度均匀度：水平温场≤0.01℃，垂直温场≤0.02℃
4、 槽体容积：18L
5、 工作区尺寸：Ф130×480mm
三、实验方法
菌种活化与种子液制备
1、 从-80℃冰箱取出冻存的酿酒酵母菌种，在YPD平板上划线接种
2、 置于30℃培养箱培养48小时，获得单菌落
3、 挑取单菌落接种至5ml YPD液体培养基中
4、 30℃、200rpm摇床过夜培养（约16小时），作为种子液
实验分组与接种
1、 将种子液按1:100的比例接种至新鲜YPD培养基中，充分混匀
2、 将接种后的菌液分装至无菌试管，每管5ml
3、 共准备30支试管，用于三个温度点（15℃、10℃、4℃）的测定，每个温度点每个时间点设置3个平行样
恒温槽准备与温度设定
1、 根据实验温度要求，向RTS-80N恒温槽内注入无水乙醇至合适液位
2、 开机，设定目标温度：
1) 第一组：15℃
2) 第二组：10℃
3) 第三组：4℃
3、 待温度稳定至设定值（显示波动≤±0.02℃）后，将试管置于专用试管架上，放入恒温槽内
4、 确保试管内菌液完全浸没在乙醇液面以下，以保证热交换充分
取样与OD值测定
各温度点分别在以下时间点取样测定：
0h、6h、12h、24h、36h、48h
取样方法：
1、 每个时间点从恒温槽中取出3支平行试管
2、 立即使用分光光度计测定OD600值
3、 记录数据，取3支试管的平均值±标准差
4、 剩余试管继续培养至下一个取样点
数据处理
以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制各温度条件下的生长曲线。
四、实验结果
不同温度下酵母生长情况
不同温度条件下酵母菌OD600值测定结果
培养时间 | 15℃组 | 10℃组 | 4℃组 |
0h | 0.12±0.01 | 0.12±0.01 | 0.12±0.01 |
6h | 0.14±0.02 | 0.13±0.01 | 0.12±0.01 |
12h | 0.19±0.02 | 0.15±0.01 | 0.12±0.01 |
24h | 0.35±0.03 | 0.21±0.02 | 0.13±0.01 |
36h | 0.61±0.04 | 0.31±0.03 | 0.14±0.01 |
48h | 0.82±0.03 | 0.43±0.02 | 0.16±0.02 |
结果分析
1、 延滞期：15℃组延滞期约为12小时，10℃组延滞期延长至24小时左右，4℃组在48小时内基本处于延滞期，未见明显生长。
2、 生长速率：15℃组在12-36小时处于对数生长期，平均生长速率约为0.035 OD/小时；10℃组在24-48小时进入对数期，生长速率约为0.018 OD/小时；4℃组在实验周期内未进入明显对数生长期。
3、 平行性：各温度点的3个平行样之间OD值标准差均小于0.04，表明恒温槽内温场均匀，各试管培养条件一致。
4、 温度稳定性：实验过程中持续监测槽内温度，15℃组温度波动范围14.98-15.02℃，10℃组9.99-10.02℃，4℃组3.98-4.02℃，均满足±0.02℃的控制要求。
五、讨论
低温对酵母生长的影响
本实验结果表明，温度对酿酒酵母的生长速率有显著影响。从30℃最适温度降至15℃时，生长速率大幅下降；降至10℃时，酵母仅能维持微弱生长；降至4℃时，生长基本停滞。这一结果与酵母的生理特性相符——低温下细胞膜流动性降低，酶活性下降，物质跨膜运输受阻，导致代谢活动减弱。
恒温设备在低温培养实验中的重要性
微生物低温培养实验对设备的温度控制能力有较高要求：
1、 温度准确性：从实验结果可以看出，15℃与10℃之间的生长差异非常明显。如果设备温度偏差达到±1℃，就可能导致15℃设定下的实际温度接近16℃或14℃，从而使实验结果偏离真实值。
2、 温度均匀性：微生物培养通常需要多个平行样同时进行，如果设备内不同位置的温度不一致，平行样之间就会产生系统误差。本实验中15℃组48h三个平行样OD值分别为0.82、0.83、0.81，标准差仅0.03，说明设备温场均匀性好，保证了实验的重现性。
3、 长期稳定性：低温培养实验往往需要持续数天。本实验连续运行48小时，温度始终稳定在设定值附近，未见明显漂移，这对于获取可靠的生长曲线数据至关重要。
制冷恒温槽在实验中的应用特点
本次实验制冷恒温槽表现出以下特点：
1、 温控精度高：±0.01℃/10min的波动度满足微生物低温培养的严格要求
2、 温场均匀：水平温场≤0.01℃、垂直温场≤0.02℃的指标保证了多平行样的一致性
3、 降温速度快：从室温降至4℃用时约20分钟，提高了实验效率
4、 操作便捷：数字显示屏实时显示温度，设定操作简单直观
5、 介质适应性好：低温区使用无水乙醇，传热效率高，温度响应快
六、结论
本实验成功测定了酿酒酵母在15℃、10℃和4℃条件下的生长曲线，结果表明：
1、 温度对酵母生长速率有显著影响，随着温度降低，延滞期延长，生长速率下降
2、 15℃条件下酵母能够完成完整的生长周期，但生长速度较最适温度大幅降低
3、 10℃条件下酵母生长极其缓慢，48小时内仅达到对数生长早期
4、 4℃条件下酵母生长基本停滞，适合短期保存
实验过程中，制冷恒温槽表现出良好的温度控制性能，为实验数据的可靠性和重复性提供了保障。该设备不仅适用于微生物低温培养，还可广泛应用于酶动力学研究、蛋白结晶、材料低温性能测试、生化试剂保存等需要精确控温的实验场景。
实验单位：本实验使用的制冷恒温槽由上海赫田科学仪器有限公司提供。该公司长期服务于科研与检测机构，合作伙伴包括武汉生物制品研究所有限责任公司、贵阳市乌当区疾病预防控制中心等单位。如需了解产品详细信息，可联系上海赫田科学仪器有限公司咨询
