一、简介
做细胞生物学实验的人都知道，线粒体提取这事儿看起来简单，但稍不注意就白干了。尤其是做环境微生物或者合成生物学里那些多菌株共培养的实验，不同种类的细胞混在一起，你要的线粒体可能来自A菌，但B菌的碎片偏偏和它密度差不多，离心劲儿大了小了都不行。这篇就是我踩了不少坑之后，总结出来的一套相对靠谱的操作流程。
二、为什么要冻着离心？
线粒体这东西温度一高，里面的酶就开始失活，膜电位也维持不住。所以从第一步开始，所有东西都得是冰上预冷过的。这也就是为什么你需要一台冷冻离心机——普通离心机转到一半，腔体温度能升到三四十度，线粒体早就报废了。
这次我用的是酿酒酵母和大肠杆菌的共培养体系，想分别提取两个菌种的线粒体做酶活对比。难点在于两种细胞的破碎难度不一样，离心参数得分别优化。
三、实验前的准备
材料和试剂：
1、 共培养48小时的混合菌液（酿酒酵母+大肠杆菌）
2、 线粒体提取缓冲液（250mM蔗糖、10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 7.4，提前一天配好放4℃）
3、 蛋白酶抑制剂（用的时候现加）
4、 玻璃珠（用于酵母破壁）
5、 溶菌酶（用于大肠杆菌破壁）
设备准备：
这台立式高速冷冻离心机提前半小时开机预冷。我把温度设定在2℃，不开玩笑，设定4℃实际腔体可能到6-7℃，所以我会稍微调低一度。转子是昨天就放进冷库的，装上转头之前用手摸了一下，确实冰手。
四、操作步骤
第一步：菌体收集
共培养液取500mL，分装到六个离心管里。这步用的是水平转子，4000rpm，4℃，10分钟。为啥不直接上高速？因为菌体太嫩了，高速可能直接压碎。
离心完倒上清的时候注意——管底的菌体有两层颜色稍微不一样，发白的是大肠杆菌，略黄的是酵母。这也是共培养实验的麻烦地方，后面还得分开。
第二步：细胞破碎
两个菌种分开处理：
1、 酵母：每管加5mL提取缓冲液重悬，再加等体积的玻璃珠。涡旋振荡，每振荡30秒冰上放1分钟，重复6次。这样比超声破碎温和，线粒体膜不容易破。
2、 大肠杆菌：重悬后加溶菌酶（终浓度1mg/mL），冰上放置20分钟，然后用玻璃匀浆器轻轻研磨15个来回。
第三步：去除细胞碎片
这步很关键。我用的是角转子，因为容量大，一次能处理6个50mL管。转速8000rpm，4℃，15分钟。沉淀的是没破壁的完整细胞和大碎片，上清里含有线粒体和其他细胞器。
第四步：线粒体沉淀
上清转移到新管子里，这回转速要大。我用的12000rpm，4℃，20分钟。沉淀的就是相对富集的线粒体部分。不过要注意，这个粗提物里多少会混一些微粒体和碎片，要求不高的话够用了。如果做酶活测定，这步就可以。
第五步：洗涤纯化（可选）
把沉淀轻轻悬在1mL缓冲液里，铺到事先配好的Percoll密度梯度液上面（30%和60%两层），8000rpm，4℃，20分钟。中间那层灰白色的带就是纯度比较高的线粒体。用长针头的注射器吸出来，再加3倍体积的缓冲液稀释，再次10000rpm离心10分钟洗掉Percoll。
五、结果和一点经验
最终我得到了大约0.8mg的酵母线粒体蛋白和0.5mg的大肠杆菌线粒体蛋白。用JC-1染色看膜电位，状态还不错的。
说几个实操中容易翻车的地方：
1、 离心机的转子要是常温的，样品放进去那几秒钟就够受的了。所以我习惯连转子都放冷库预冷。
2、 升降速别选太快。我那台机子上有个“慢加速慢减速”模式，选那个。突然加速会把沉淀搅起来，得不偿失。
3、 多管离心记得配平。用了几次不平衡保护功能，机器自己报警停机了，确实省了不少麻烦。
六、设备的选择
其实实验室之前有两台离心机，一台老的不能控温，夏天根本没法用。后来换了这台上海赫田科学仪器有限公司的立式高速冷冻离心机，主要看中它几点：一个是预冷快，从室温到2℃大概十来分钟；另一个是噪音确实小，之前那台跟飞机起飞似的，这台也就正常说话的音量。20种升减速选择挺实用，做线粒体这种脆弱的样品我就选慢档，做普通菌体收集就选快档，一把就能调出来。
用了一年多，感觉比较踏实。像亚热带森林培育国家重点实验室、深圳市第一人民医院、哈尔滨延寿香其酱业有限公司等他们也用过这个牌子的设备，说明在生物和食品领域还是经受住了考验。
七、结尾
上海赫田专注于恒温摇床、恒温振荡器、震荡培养箱、细胞培养摇床等。
要是你们也做微生物共培养、合成生物学这类需要同时养好几个菌的实验，或者手头的离心机控温不太行了，可以问问上海赫田的技术人员，让他们根据你的样品量和转子需求给个建议。毕竟设备这东西，参数看着差不多，但用久了就知道稳不稳了。
