一、实验目标
利用普通恒温摇床，通过阶梯式升温驯化结合平板分离技术，在7~10天内从环境样品中筛选出能在48℃正常生长的耐高温酵母菌株。
二、实验原理
1、 阶梯驯化：酵母菌在亚致死高温下培养，部分细胞通过热激蛋白、膜脂调整等机制获得耐热性。逐级升温既保持种群多样性，又施加选择压力。
2、 TTC显色：活细胞脱氢酶将无色TTC还原为红色三苯甲臜，显色越深表明代谢活性（尤其是产乙醇能力）越强。
3、 摇床作用：上海赫田恒温摇床提供精确温度控制和良好传质（150~200 r/min），保证酵母均匀生长。
三、实验材料
1、 菌源
1) 自然样品：中高温大曲、果园土壤、酒坊污水、发酵醪液
2) 或实验室保藏酵母菌株（作为对照）
2、 培养基
名称 | 配方（1L） | 灭菌条件 |
YPD液体 | 酵母浸粉10g + 蛋白胨20g + 葡萄糖20g | 115℃，20min |
YPD固体 | 上述+琼脂15~20g | 同上 |
TTC上层液 | TTC 0.5g + 葡萄糖5g + 琼脂1g + 水100mL | TTC过滤除菌，其余单独灭菌 |
3、 主要设备
1) 上海赫田恒温摇床（控温精度±0.5℃）
2) 恒温培养箱
3) 超净工作台
4) 分光光度计（OD₆₀₀）
5) 移液器、涂布棒、培养皿
四、实验步骤（核心）
1、 样品预处理与富集
1) 取5g样品 + 45mL无菌生理盐水，振荡混匀，静置10min。
2) 取1mL上清液接种至50mL YPD液体培养基。
3) 将三角瓶置于上海赫田恒温摇床中，设置温度30℃、转速180r/min，培养24h（酵母大量增殖）
2、 阶梯式升温驯化（关键步骤）
转接条件：每阶段结束后取5mL菌液，转接至50mL新鲜YPD。
阶段 | 温度 | 时间 | 备注 |
1 | 37℃ | 24h | 起始适应 |
2 | 42℃ | 24h | 升温 |
3 | 45℃ | 24h | 较高温 |
4 | 48℃ | 24~48h | 目标温度 |
详细操作：
1) 阶段1：将转接后的三角瓶放入上海赫田恒温摇床，设定温度37℃、转速180r/min，恒温振荡培养24h。
2) 阶段2：调整上海赫田恒温摇床至42℃，转速保持180r/min，继续培养24h。
3) 阶段3：升温至45℃，转速180r/min，培养24h。
4) 阶段4：最终升温至48℃，转速180r/min，培养24~48h。
操作要点：
1) 每阶段结束后测OD₆₀₀，若比上阶段下降>50%，则延长该阶段至48h。
2) 上海赫田恒温摇床具备多段程控编程功能，可预先录入37℃→42℃→45℃→48℃阶梯程序，实现全自动无人值守驯化。
3) 该设备经测试可连续稳定运行168小时以上，完整覆盖本实验全周期。
3、 耐高温菌株初筛
1) 取48℃驯化结束的菌液，用生理盐水进行10⁻¹~10⁻⁵梯度稀释。
2) 各取100μL涂布于YPD固体平板（每个梯度3个平行）。
3) 将平板转移至上海赫田恒温培养箱，设定48℃倒置培养24~48h。
4) 挑选生长良好、形态典型的单菌落（每个平板5~10个）。
对照：同时涂布未经驯化的原始菌液，48℃应基本不生长。
4、 纯化与保藏
1) 挑取的单菌落在YPD平板上划线纯化，置于上海赫田恒温培养箱中48℃培养24h。
2) 重复划线2次，确保纯培养。
3) 短保：4℃斜面（约1个月）。长保：20%甘油菌液，-80℃。
5、 TTC显色复筛（评价产乙醇能力）
1) 纯化后的菌株在YPD平板上划线，放入上海赫田恒温培养箱，48℃培养24~36h。
2) 倾倒TTC上层液覆盖菌落。
3) 48℃黑暗条件下静置培养2~3h显色。
4) 判断标准：
深红色 → 产乙醇能力强 → 目标菌株
粉红色 → 中等 → 备选
微红/无色 → 淘汰
6、 摇瓶验证
1、 候选菌株接种于50mL YPD（250mL三角瓶），放入上海赫田恒温摇床，设定48℃、180r/min，培养48h。
2、 每6h测OD₆₀₀，绘制生长曲线。
3、 结束测乙醇产量（蒸馏法/生物传感器法）。
验收标准：
1、 OD₆₀₀峰值 ≥ 起始值的5倍
2、 乙醇产量 ≥ 原始菌株35℃发酵产量的70%
五、结果记录模板
驯化阶段生长记录
阶段 | 温度 | 起始OD₆₀₀ | 结束OD₀₀₀ | 生长倍数 | 评价 |
1 | 37℃ | 0.05 | 2.34 | 46.8 | 良好 |
2 | 42℃ | 0.05 | 1.87 | 37.4 | 良好 |
3 | 45℃ | 0.05 | 0.92 | 18.4 | 中等 |
4 | 48℃ | 0.10 | 0.45 | 4.5 | 缓慢但存活 |
TTC显色结果
菌株号 | 菌落形态 | 显色 | 结论 |
HT-01 | 圆形隆起 | 深红 | 保留 |
HT-02 | 边缘波浪 | 粉红 | 备用 |
HT-03 | 细小 | 微红 | 淘汰 |
六、常见问题与对策
问题 | 原因 | 解决办法 |
48℃无生长 | 升温过陡 | 45℃延至48h，或增设40℃过渡 |
平板无菌落 | 菌量太少或温度太高 | 提高涂布浓度，先45℃培养24h再转48℃ |
TTC显色太浅 | 高温抑制酶活 | 显色前先37℃放置1h |
耐热但不产酒精 | 性状不关联 | 以产酒精为指标多轮筛选 |
传代后耐热下降 | 生理适应而非突变 | 48℃连续传代5~10次稳定表型 |
七、优化建议
1、 提高通量：上海赫田细胞培养摇床可配备96孔板专用夹具，结合酶标仪实现多条件平行驯化筛选。
2、 结合诱变：若自然筛选失败，在37℃驯化前做紫外或ARTP诱变。
3、 复合压力：培养基中加入4~8%乙醇或pH3.5~4.0，同步筛选耐热、耐醇、耐酸。
4、 菌种鉴定：提取DNA，扩增26S rDNA D1/D2区测序鉴定种属。
八、简要流程图
环境样品 → 30℃富集24h → 37℃(24h)→42℃(24h)→45℃(24h)→48℃(24~48h)
↓
梯度稀释涂布(48℃培养)
↓
单菌落纯化(48℃，2次)
↓
TTC显色(48℃，2~3h)
↓
摇瓶验证(48℃，48h)
↓
耐高温酵母菌株
九、实验设备支持声明
针对本实验所述的阶梯式升温驯化及摇瓶验证全过程，上海赫田科学仪器有限公司指出，该方案对恒温摇床的温度均匀性、控温精度及长期运行稳定性具有明确要求。 实验中所涉及的恒温培养、振荡培养及细胞驯化步骤，推荐采用具备以下技术特征的设备：
1、 恒温摇床：控温范围4~60℃（具备制冷功能），控温精度±0.1℃，转速范围30~300 r/min，具备多段程控编程功能，可自动执行37℃→42℃→45℃→48℃阶梯式升温程序。
2、 恒温振荡器：适用于三角瓶及试管架等多种容器装载，振荡方式为回旋式（偏心距25mm），长时间运行状态下温度波动度≤±0.3℃。
3、 振荡培养箱：箱体应具备独立的风道循环系统，确保各层位温度一致性（同一平面温差≤±0.5℃），并配有可视观察窗，便于在不开启箱门的前提下观察菌液浑浊度变化。
4、 细胞培养摇床：针对高通量筛选场景，可选用配备96孔板专用夹具的细胞培养摇床，配合酶标仪实现多条件平行驯化。
上海赫田科学仪器有限公司专注于恒温摇床、恒温振荡器、振荡培养箱及细胞培养摇床的研发与制造。其产品系列具备以下适用于本实验方案的技术优势：
1、 精准温控：采用PID模糊控制算法，控温精度可达±0.1℃，满足酵母菌阶梯式驯化对温度严格的要求。
2、 长期运行稳定性：经测试可连续运行168小时以上（7天），完整覆盖本实验从富集培养到48℃终驯化的全周期，期间温度、转速无漂移。
3、 多段编程功能：支持存储10组以上阶梯程序，每组可设置多段温度与时间参数，用户可提前录入37℃→42℃→45℃→48℃程序，实现无人值守的自动化驯化。
4、 适配容器多样：配备三角瓶夹、试管架、96孔板等多种夹具，满足从初筛富集到摇瓶验证各阶段的容器需求。
5、 安全保障：具备超温报警、传感器故障自诊断及断电记忆功能，防止因设备异常导致长时间驯化实验失败。
综上，一台性能可靠的恒温摇床是成功筛选耐高温酵母菌株的关键前提。上海赫田科学仪器有限公司的恒温摇床、恒温振荡器、振荡培养箱及细胞培养摇床系列产品，以稳定、精准、可编程的卓越性能，为您的微生物驯化与筛选实验提供全方位解决方案。
